Введение

В настоящее время разрабатывается большое количество вариантов технологических решений по ликвидации последствий загрязнений бытовыми и промышленными отходами, в том числе с использованием биотехнологий. Возможность утилизации полимерных материалов микроорганизмами зависит от множества условий и факторов [1–4]. Молекулы полимеров, взаимодействующие с водой, могут быть подвергнуты биодеструкции [1–5], в то же время полимеры, в которых отсутствуют гидролизуемые функциональные группы, подвергаются биодеструкции только с использованием специализированных штаммов и условий экспонирования [4–7].

Для разработки методов оценки биодеструкции различных материалов ускоренными лабораторными методами необходимо с высокой степенью достоверности определять воздействие именно микрофлоры на образцы [7, 8].

Цель второй части обзора – определение методов анализа изменения структуры и химического состава образцов полимерных материалов, а также оптимальной формы образцов.

Работа выполнена при поддержке ЦКП «Климатические испытания» НИЦ «Курчатовский институт» – ВИАМ.

Сравнение отечественных и зарубежных стандартов испытаний

полимерных материалов

на стойкость к воздействию микроорганизмов

Изучение деструктивного воздействия штаммов микромицетов проводят в основном по двум методикам – ГОСТ 9.049–91, метод 1 и ASTM G21-15 [9]. Данные методы основаны на визуальной оценке степени обрастания поверхности материала микрогрибами. Воздействие морской воды и биообрастателей регламентируется стандартом ASTM D4939–89 [10]. Стандарты распространяются на лакокрасочные покрытия (ЛКП) и их испытания в морской среде, однако ГОСТ требует проведения испытания ЛКП, нанесенных на металлические материалы, а ASTM – на металлические и неметаллические материалы. В ГОСТ регламентируется продолжительность испытаний материалов в морской среде в течение одного года и двух лет, а в ASTM ‒ в течение одного года для всех климатических сезонов. По ГОСТ требуется проведение испытаний в местах предполагаемой эксплуатации, а в ASTM такое требование отсутствует. При обработке результатов испытаний по ГОСТ используют шкалу обрастания микрогрибами, в ASTM – методику обсчета результатов. Продолжительность испытаний по ГОСТ и ASTM одинакова – не менее одного года или в течение всех климатических сезонов.

Сравнительные испытания фунгицидов регламентируют ГОСТ 9.803–88 [11] и иностранные стандарты ASTM E2111-05 [12], ASTM Е2783-11 [13], ASTM Е645-13 [14]. При проведении испытаний по ГОСТ регламентируется применение большого количества видов грибов и различных концентраций фунгицидов. Отличаются продолжительности проведения испытаний: по ГОСТ – не более 42 сут с осмотром не реже раз в 7  сут; по ASTM – от 5 до 30 сут в зависимости от питательной среды.

Испытания микробиологической стойкости ЛКП в лабораторных условиях на воздействие микромицетов регламентируются отечественными (ГОСТ 9.050–75 [15], ГОСТ 9.058–75 [16]) и иностранными стандартами (ASTM D4610-98, ASTM D5588-97 [17], ASTM D5590-00 [18]). По ГОСТ регламентируется проведение оценки стойкости ЛКП к плесневым грибам по интенсивности их роста и степени разрушения покрытия, а в ASTM устанавливаются наличие грибков или водорослей на ЛКП, а также методы их удаления и определение относительной стойкости ЛКП. В отечественных и иностранных стандартах отличаются подготовка питательных сред и образцов к проведению испытаний, а также их размеры. Если ГОСТ регламентирует конкретные размеры образцов (50×50 или 60×40 мм) при проведении испытаний, то в ASTM такие требования не предъявляются. По ГОСТ прописывается применение 10 видов грибов при проведении испытаний, а в ASTM – всего 3 вида. Режим проведения испытаний аналогичен: температура 28 °С, относительная влажность 90 %, продолжительность приблизительно 4 недели (28 сут), оценка результатов испытаний – визуальный осмотр.

Проведение испытаний на микробиологическое разрушение тканей в лабораторных условиях регламентируют отечественный стандарт ГОСТ 9.060–75 [19] и зарубежные стандарты ASTM D7475-20 и ISO 17556–2012 [20]. Регламентируется проведение испытаний на стойкость к аэробным микроорганизмам почвенной микрофлоры. Требования к среде проведения испытаний, составу грунта, температуре и контейнеру для проведения испытаний одинаковы по отечественным и зарубежным стандартам. Однако продолжительность по ГОСТ составляет 10 сут, а по ASTM и ISO: 28 сут.

Проведение испытаний вододиспергируемых смазочно-охлаждающих жидкостей на воздействие бактерий и грибов в лабораторных условиях регламентируют отечественный стандарт ГОСТ 9.085–78 [21] и иностранный стандарт ASTM E2694-21. Принципиальное отличие в стандартах, заключается в определении по ГОСТ стойкости с выдержкой смазочно-охлаждающих жидкостей, зараженных бактериями и грибами, в оптимальных для их роста условиях, в ASTM – с определением содержания аденозинтрифосфата. По ГОСТ определяются количество видов грибов для испытаний и несколько методов их проведения, в ASTM такие требования отсутствуют. Отличается также и обработка результатов: по ГОСТ обрастание оценивают по бальной шкале, а в ASTM – по содержанию аденозинтрифосфата в образце.

Определение эффективности антибактериальных присадок для топлива регламентируется отечественным стандартом ГОСТ 9.023–74 [22] и иностранным стандартом ASTM E1259-16 [23]. В стандартах представлены различные методики подготовки к проведению испытаний, которые отличаются количеством видов грибов, применяемых в испытания: 5 – в ГОСТ, а 3 – в ASTM. Различается также обработка результатов: по ГОСТ регламентируется визуальный осмотр, в ASTM сравнивается  количество микроорганизмов с контрольным образцом.

Проведение испытаний на микробиологическую стойкость регламентируется отечественным стандартом ГОСТ 9.049–91 [24] и иностранными стандартами ASTM C1338-08 [25], ASTM G21-15 [26], ASTM D4783-01 [27]. Отечественный ГОСТ и иностранные стандарты методически близки, но отличаются подготовкой суспензии спор и применяемых микроорганизмов. Режимы проведения испытаний в ГОСТ и иностранных стандартах одинаковы вследствие выбора оптимальных условий для роста организмов. Различается обработка результатов испытаний: ГОСТ регламентирует бальную систему, в ASTM сравниваются образцы, проведшие испытания, с контрольными.

Перечисленные стандарты и соответствующие методы исследований процессов биодеструкции включают в себя два основных типа – это исследование в натурных условиях без добавления специальных питательных сред и оценка биостойкости в лабораторных условиях на специальных питательных средах. Итогом данных испытаний является определение количества пораженных участков материала и/или количество выросших клеток микрогрибов и бактерий.

Главное при проведении стандартных исследований – определение роста микроорганизмов, а не изменение свойств (биодеструкция) самих материалов.

Методы исследования степени биодеструкции материалов

Разработка методов оценки степени деструкции собственно материала привела к созданию стандартов испытаний различных биоразлагаемых полимеров (БРП) – поливинилового спирта, оксида полиэтилена, полилактата, хитозана, поликапролактона, крахмала и др., для проверки их способности к биоразрушению в присутствии специально подобранных штаммов микроорганизмов.

Метод абсорбции диоксида углерода. В частности, могут представлять интерес испытания, в которых проводят косвенную оценку степени разрушаемости материала микроорганизмами, основываясь на показателях уровня диоксида углерода или кислорода. Например, в стандарте испытаний ISO 14855-1999 [28], в том числе, описан метод анализа высвобожденного углекислого газа в процессе ферментации пленок БРП микроорганизмами в минеральной среде, где в качестве единственного или основного источника углерода служит пленка полимерного материала (см. рисунок).

Схема устройства, позволяющего определить количество CO₂,

получаемого в процессе деструкции биоразлагаемого материала:

⇢ – CO₂; ⇢ – воздух без CO₂

Устройство состоит из воздушной помпы, колб для поглощения углекислого газа из воздуха, биореактора и колб для поглощения высвобождаемого в процессе ферментации диоксида углерода. Воздух пропускают через абсорбционные колбы 1–2, содержащие раствор NaOH, для удаления неорганического СО₂ из воздуха. Далее воздух, свободный от CO₂, поступает в реактор (колба 4) с культурой микроорганизмов в минеральной среде и пластиной испытываемого материала. В процессе ферментации в реакторе поддерживают оптимальную для роста микроорганизмов температуру при постоянном перемешивании ферментационной среды. Органический диоксид углерода, полученный в результате ферментации материала,  снова абсорбируется в колбах 5–7 раствором Ba(OH)₂ в виде карбоната бария BaСО₃. Раствор гидроксида бария в колбе 3 служил в качестве индикатора отсутствия СО₂ в подаваемом в ферментер воздухе. Количество поглощенного таким образом органического СО₂ в колбах 5–7 можно определить путем титрования оставшегося Ba(OH)₂ с соляной кислотой:

СО₂ + Ba(OH)₂ → BaСО₃ + Н₂О;

Ba(OH)₂ + 2HCl → BaCl₂ + 2H₂O.

Для подсчета величины абсолютного показателя уровня биодеструкции используют отношение теоретического содержания СО₂ в исходной навеске материала и полученного в результате биоконверсии [28].

Инкубирование с ультрафиолетовым излучением. Образцы полимеров инкубируют с микроорганизмами – потенциальными деструкторами, периодически подвергая ультрафиолетовому излучению для естественной деструкции поверхностного слоя – старения. Обычно старение материала в течение нескольких дней идет интенсивно, затем замедляется. Биодеструкция при такой постановке опыта сопровождается как потерей массы образцов, так и снижением молекулярной массы полимерных молекул. Эти параметры являются оценочными [29].

Методы выдержки образцов полимеров в компосте. Эти методы регламентируются рядом стандартов – ASTM D5338-15 [30], ASTM D5509-96 [31]. Сущность метода заключается в фиксации количества выделяющегося СО₂ во время экспозиции.

Метод радиоизотопных меток. Суспензию микрогрибов выдерживают в радиоактивной среде паров тритиевой воды, после чего полимерные материалы заражают микрогрибами с радиоактивной меткой. Накопление радиоактивного изотопа полимерным материалом фиксируется и по интенсивности сигнала сцинтилляционного счетчика можно судить о степени проникновения микрогрибов в материал [32]. С использованием данного метода также можно оценивать степень усвоения полимерного материала грибами и бактериями при инкубировании материала, насыщенного тритием. В этом случае увеличение радиоактивного фона микроорганизмов свидетельствует о поглощении ими полимера [33].

Люминисцентные и спектральные методы. Биолюминесцентный метод основан на принципе реакции люциферин-люциферазной системы, интенсивность свечения которой пропорциональна концентрации аденозинтрифосфата в исследуемой пробе. Концентрация аденозинтрифосфата во всех живых клетках одинакова и составляет ~0,5 % сухой массы.

Инфракрасная спектроскопия позволяет выявить основные спектры поглощения функциональных групп белков и определить наличие тех или иных белковых структур.

Тонкослойная хроматография позволяет определить концентрацию карбоновых кислот в жидкой пробе наросших на поверхности биоотложений.

Газожидкостная хроматография позволяет оценивать и идентифицировать продукты жизнедеятельности микроорганизмов [34–36].

Молекулярно-биологические методы. Полимеразная цепная реакция в реальном времени (ПЦР-РВ от англ. Real-time PCR – qPCR) – лабораторный метод, основанный на методе ПЦР, позволяющий определять присутствие целевой нуклеотидной последовательности в образце и измерять количество ее копий. Количество амплифицированной ДНК измеряется после каждого цикла амплификации с помощью флуоресцентных меток. Оценка может быть количественной – измерение количества копий матрицы, а также относительной – измерение относительно внесенной ДНК или дополнительных калибровочных генов. Если известна видовая принадлежность микроорганизмов, применяемых для испытаний материалов, то на основе калибровочных данных стандартных образцов этих культур с помощью ПЦР-РВ можно весьма точно измерить приращение плотности культуры, происходящее по мере уменьшения массы материала в процессе испытаний [37].

Провести подсчет клеток можно и классическим методом кратного рассева на соответствующую виду микроорганизма питательную среду с дальнейшим подсчетом колоний в штуках. В отличие от приведенного ранее метода ПЦР-РВ, метод подсчета колоний менее точен, может приводить к ошибкам и артефактам, кроме этого занимает существенно больше времени.

Микроскопия. Световая микроскопия позволяет оценить степень обрастания материала по наличию колоний микроорганизмов на его поверхности – например, некоторые колонии грибов могут быть различимы  с учетом размеров их клеток, составляющих >10 мкм. Использование такого типа микроскопии также позволяет в целом оценить поверхностную эрозию материала. Методы электронной микроскопии дают возможность детально просканировать внешнюю диффузионно-кинетическую область поверхности, определив характер и профиль эрозии поверхностного слоя, отметить места расположения бактериальных биопленок и отдельных микроорганизмов в местах попадания влаги в разрушенную структуру материала [38].

Форм-фактор образцов для исследования процессов биодеструкции

Биодеструкция, так же как любой процесс деструкции в результате коррозии или старения, начинается с поверхности материала. Чем больше площадь поверхности полимера, тем быстрее должна происходить биодеструкция. В работе [39] описан метод исследования биодеструкции на порошках различной крупности. Порошки поликапролактона (PCL) готовили из гранул PCL с использованием вращающегося механического смесителя – их разделяли с помощью сит с количеством 60 и 120 ячеек на четыре класса: 0–125, 125–250, 0–250 и 250–500 мкм. Испытания на биодеградацию порошков PCL и порошков целлюлозы в водном растворе при температуре 25 °C проводили с использованием кулонометра в соответствии со стандартом ISO 14851‒2022. Испытания на биодеградацию порошков PCL и целлюлозы в контролируемом компосте при температуре 58 °C проведены Mitsui Chemical Analysis and Consulting Service, Inc. в соответствии с ISO 14855-1:2012 и с использованием прибора Microbial Oxidative Degradation Analyzer (MODA) в соответствии с ISO/DIS 14855-2:2018. Порошки PCL подвергали более быстрому биологическому разложению, чем порошки целлюлозы. Тест на ферментативную деградацию порошков PCL различных классов проведен с использованием фермента липазы PS. В данном случае порошок PCL с меньшим размером частиц быстрее разлагался ферментом. Порошки PCL с регулируемыми размерами частиц от 125 до 250 мкм предложены в качестве эталонного материала для теста на биодеградацию.

Тесты на порошках позволяют достаточно быстро оценить процесс биодеструкции спектральными и химико-аналитическими методами. Однако для отслеживания процесса во времени, визуализации процесса и определения стадий и реакций биодеструкции используются плоские образцы материалов различной толщины – от пленок толщиной 20–100 мкм до образцов толщиной 5–10 мм.

Именно на образцах в виде пленки впервые определен вид бактерий, приводящих к деструкции полиэтилентерефталата. С применением таких образцов можно использовать как спектральные и химико-аналитические методы, так и методы оптической и электронной микроскопии.

Исследование глубины проникновения микроорганизмов в толщу образца, а также объемных биоповреждений возможно только на образцах, имеющих достаточную для инструментальной оценки толщину.

Заключения

Для изучения фазы фрагментации полимерных материалов в природных средах наиболее подходящими способами анализа являются радиохимический метод и методы оптической и электронной микроскопии. При этом лучше использовать плоские или пленочные материалы.

На стадии ферментации наиболее подходящими методами исследования процессов биодеструкции являются спектральные методы на плоских и пленочных образцах.

Изучение скорости ассимиляции полимерных материалов целесообразно проводить с применением порошковых образцов методами фиксации изменения химического состава газов и питательных сред.