Введение

Актуальность проблемы утилизации пластиковых отходов в последние годы не вызывает сомнений в связи с постоянным ужесточением экологических требований [1–6]. Одним из подходов к решению данной проблемы является биодеградация синтетических пластиков под действием микроорганизмов (бактерий и грибов). Подробный анализ процессов биоразложения синтетических термопластичных полимеров и пластиков на их основе приведен в обзорной работе [1].

Наиболее разрушительным для материалов является тропический климат, характеризующийся высокими значениями температуры и относительной влажности воздуха, а также интенсивным УФ-излучением, что в случае полимерных материалов вызывает их старение. Кроме того, биоразнообразие тропических экосистем, в том числе островных, отличающихся высоким уровнем эндемичности, обеспечивает широкий спектр микроорганизмов, среди которых с высокой вероятностью будут выявлены виды, способные к биоразложению пластиков.

Представляется актуальным изучение биодеградации пластиков посредством воздействия микробиологической среды, характерной для островных тропических экосистем. Подобные исследования позволят выбрать наиболее агрессивные для синтетических пластиков микроорганизмы с целью последующей разработки технологий биоразложения наиболее широко используемых в промышленности полимеров. Одним из ярких представителей тропических островных экосистем является экосистема острова Куба.

Данная работа посвящена изучению воздействия в лабораторных условиях штаммов микромицетов, выделенных в условиях экосистемы острова Куба, на образцы пластиковых пленок (полиэтилен низкого давления (ПНД), полиэтилен высокого давления (ПВД), полипропилен (ПП), поливинилхлорид (ПВХ) и полиэтилентерефталат (ПЭТФ)).

Материалы и методы

Для исследования взяты 5 видов полимерных пленочных материалов (табл. 1), представляющих наиболее широко используемые в промышленности виды пластиков, и 13 штаммов микромицетов, выделенных с поверхности различных материалов в условиях экосистемы острова Куба (табл. 2).

Таблица 1

Полимерные пленочные материалы, используемые в эксперименте

Таблица 2

Перечень штаммов микромицетов, выделенных с поверхности материалов

в условиях экосистемы острова Куба

Для подтверждения деструктивной активности выделенных штаммов предварительно проведено исследование активности роста всех выделенных штаммов микромицетов на селективных питательных средах: агаризованной минеральной среде с добавлением микрокристаллической целлюлозы (в качестве единственного источника углерода) и агаризованной минеральной среде без целлюлозы (в качестве контроля). По характеру роста и морфологическим признакам установлено, что выделенные штаммы являются потенциальными деструкторами и представляют интерес для дальнейших исследований влияния их роста на свойства различных групп материалов. К таким морфологическим признакам относится более плотный и объемный внешний вид колоний, обильное образование воздушного мицелия, более интенсивное развитие спороношения и более яркая пигментация мицелия [7].

Перед испытанием на грибостойкость образцы полимерных пленок взвешивали на аналитических весах AND GH-200.

Изучение деструктивного воздействия штаммов микромицетов проводили по двум методикам – по ГОСТ 9.049–91 (метод 1) и по ASTM G21-15 (рис. 1). Для проведения испытаний пленок по выбранным методикам использовали суспензию спор микромицетов согласно ГОСТ 9.048–89. Для приготовления суспензии микромицеты предварительно выращивали на чашках Петри с агаризованным суслом в течение 10–14 дней при температуре 28±2 °C. Затем в стерильных условиях с помощью бактериологической петли, прокаленной в иглопрокаливателе, переносили споры микромицетов в стеклянную емкость со стерильной дистиллированной водой. При взятии спор избегали касания поверхности твердой питательной среды. Суспензию спор каждого вида гриба тщательно перемешивали путем встряхивания до разделения всех комочков спор и отфильтровывали через 4 слоя стерильной марли от фрагментов мицелия, агара и комочков спор. Концентрацию спор каждого гриба в отдельности подсчитывали с помощью камеры Горяева, а при необходимости добавляли стерильную воду до получения необходимой концентрации. Для испытаний использовали суспензию с концентрацией спор каждого вида гриба 1–2 млн/см³ (по ГОСТ 9.048–89).

Рис. 1. Проведение испытаний по ГОСТ 9.049–91 (а) и по ASTM G21-15 (б)

При испытании по ГОСТ 9.049–91 (метод 1) образцы полимерных материалов инокулировали суспензией спор микромицетов с помощью пульверизатора. Инокуляцию осуществляли равномерно по всей поверхности образцов. Контрольные образцы не подвергали инокулированию. Инокулированные и контрольные образцы полимерных пленок помещали в специальные камеры, которые поддерживают заданные температуру и влажность. Образцы экспонировали в камерах в течение 28 сут при температуре 28±2 °C и относительной влажности воздуха >90 %. После завершения испытаний образцы извлекали из камеры, осматривали, микроскопировали при увеличении ×50 и проводили оценку грибостойкости по 6-балльной шкале (по ГОСТ 9.048–89).

При испытании по ASTM G21-15 готовили чашки Петри с агаризованной средой, на поверхности которой после ее затвердевания размещали образцы испытываемых полимерных материалов. Далее, как и в методике по ГОСТ 9.049–91 (метод 1), инокулировали всю поверхность среды вместе с образцами суспензией спор микромицетов. Инокулированные и контрольные образцы полимерных пленок помещали в специальные камеры, которые поддерживают заданные температуру и влажность. Образцы экспонировали в камерах в течение 28 сут при температуре 28±2 °C и относительной влажности воздуха >90 %. После завершения испытаний образцы извлекали из камеры, осматривали, выполняли микроскопирование (при увеличении ×50) и проводили оценку грибостойкости по 5-балльной шкале (по ASTM G21-15).

В завершение оценки грибостойкости образцы пленок очищали от органических загрязнений с помощью ваты и этанола, а затем проводили взвешивание на аналитических весах AND GH-200.

С целью подтверждения биодеградации образцов полимерных пленок под действием штаммов микромицетов-деструкторов, после взвешивания образцы подвергали испытанию при растяжении (по ГОСТ 14236–81). Испытание проводили на испытательной машине ИР 5046-5 при следующих условиях: высота рабочей зоны 50 мм, скорость растяжения 100 мм/мин.

Результаты и обсуждение

Выбор ГОСТ 9.049–91 (метод 1) для определения грибостойкости испытываемых полимерных пленок обусловлен тем, что данная методика позволяет делать вывод о содержании компонентов, поддерживающих рост и развитие микроорганизмов, а также предусматривает приготовление споровой суспензии в воде без добавления каких-либо компонентов. В случае активного роста микромицетов (более 3 баллов по шкале, представленной в ГОСТ 9.048–89) можно утверждать, что материал не является грибостойким и что микромицеты развиваются благодаря усвоению самого материала. При проведении испытания по ASTM G21-15 рост микромицетов происходит благодаря питательной среде, которая выполняет роль подложки для испытываемых материалов. В данном случае идет более интенсивное воздействие на испытываемые материалы. Указанная методика, как правило, применяется для исследования материалов, которые эксплуатируются в условиях наличия органических загрязнений, а также для определения фунгицидных и фунгистатических свойств материалов.

Результаты по определению грибостойкости образцов полимерных пленок после 28 сут испытаний по ГОСТ 9.049–91 (метод 1) и ASTM G21-15 представлены в табл. 3. Видно, что для 4 из 5 исследованных типов полимерных материалов характерен балл грибостойкости, равный 1.

Таблица 3

Грибостойкость полимерных пленок после 28 сут испытаний

При микроскопировании после испытания по ГОСТ 9.049–91 (метод 1) на поверхности материалов наблюдали отдельные проросшие в гифы споры (рис. 2). Однако на образцах полимерных пленок ПВХ отмечено активное развитие грибов (рис. 2, д, е), что проявлялось в наличии спороношения и хорошо развитого мицелия, покрывающего >25 % площади испытываемых образцов.

Рис. 2. Поверхность образцов полимерных материалов ПВД (а), ПНД (б), ПП (в),

ПЭТФ (г) и ПВХ (д, е) после испытания по ГОСТ 9.049–91 (метод 1)

При проведении испытания по ASTM G21-15 уже на 3–5 сут наблюдали образование колоний микромицетов на питательной среде, а на 7 сут мицелием была покрыта вся поверхность среды, за исключением тех мест, где находились образцы полимерных пленок. Следует отметить, что при испытании по данной методике материал подвержен воздействию вторичных метаболитов, выделяемых микромицетами в процессе роста на питательной среде, если даже сам по себе не является питательным субстратом для грибов. Как и при испытании по ГОСТ 9.049–91 (метод 1), отмечено слабое развитие микромицетов на образцах четырех типов полимерных материалов – ПВД, ПНД, ПЭТФ и ПП. Активное развитие мицелия и наличие большого количества спороношений отмечены для образцов ПВХ (рис. 3).

Рис. 3. Поверхность образцов полимерных материалов ПВД (а), ПНД (б),

ПП (в), ПЭТФ (г) и ПВХ (д) после испытания по ASTM G21-15

С целью определения степени воздействия микромицетов на полимерные пленки, помимо визуальной оценки степени обрастания, проведено измерение массы образцов до и после испытания на грибостойкость. Результаты представлены в табл. 4–6.

В табл. 4 приведены данные для образцов, которые находились в условиях повышенной влажности (>90 %), но не подвергались воздействию грибов. Видно, что для всех 5 типов пластиков можно наблюдать незначительное увеличение массы, что, вероятно, связано с влагопоглощением полимерных материалов. Наибольшее увеличение массы (8,5 %) отмечено в случае образцов ПЭТФ.

Таблица 4

Результаты взвешивания контрольных образцов полимерных пленок, находившихся

в условиях повышенной влажности (>90 %), до и после испытания на грибостойкость

Масса образцов, подвергшихся воздействию микромицетов, практически не изменилась как в случае проведения испытания по ГОСТ 9.049–91 (метод 1), так и в случае более жестких условий испытания по ASTM G21-15 (табл. 5 и 6). Можно предположить, что масса образцов при проведении испытаний изменялась в двух направлениях:в сторону увеличения в процессе влагонасыщения образцов пластиков и в сторону уменьшения в результате биологической деградации образцов под воздействием вторичных метаболитов микромицетов. Для проверки данного предположения необходимо проведение исследований более длительного воздействия микромицетов на полимерные пленки.

Дополнительно выполнено взвешивание образцов ПВХ сразу после завершения испытания по ГОСТ 9.049–91 (метод 1), поскольку данный материал оказался единственным, на котором наблюдалось активное развитие грибов. Взвешивание проведено с образовавшейся на поверхности образцов биомассой. Как видно из данных, представленных в табл. 5, масса образцов с грибами снизилась по сравнению с исходной на ~0,3 % (0,0008 г), а после смыва биомассы – еще на 0,1 % (0,0002 г). В случае воздействия по ASTM G21-15 уменьшение массы образцов составило 0,15 % (0,0004 г). Взвешивание вместе с биомассой после испытания по ASTM G21-15 не проводили, поскольку образцы в процессе испытания находились на питательной среде и определение массы образцов с остатками среды и мицелия с чашек привело бы к некорректному результату.

Таблица 5

Результаты взвешивания образцов полимерных пленок

до и после испытания по ГОСТ 9.049–91 (метод 1)

Таблица 6

Результаты взвешивания образцов полимерных пленок

до и после испытания по ASTMG21-15

Выбор испытания при растяжении в качестве дополнительного метода исследований обусловлен тем, что изменения механических свойств очень чувствительны к изменениям молекулярной массы полимера, которая может служить индикатором деградации. Как отмечается в работах [8–17], изменение какого-либо механического свойства полимера (особенно прочности при растяжении) часто используется в качестве параметра биодеградации при минимальной потере массы.

Результаты испытания при растяжении для образцов полимерных пленок, предварительно подвергнутых испытанию на грибостойкость, а также для контрольных образцов, которые не подвергались воздействию штаммов микромицетов, представлены в табл. 7–9. Следует отметить, что испытание при растяжении проводили только для образцов ПВХ, поскольку на них наблюдался наиболее активный рост микромицетов. Наибольшее значение относительной потери массы (0,6 %) для образцов ПЭТФ в случае испытания по ASTM G21-15 можно объяснить наличием в молекуле ПЭТФ подверженной гидролизу эфирной связи, что облегчает процесс биодеградации по сравнению с карбоцепными полимерами [8].

Из данных, представленных в табл. 7–9, следует, что прочность при растяжении образцов ПВХ, предварительно подвергнутых испытанию на грибостойкость, на ~4 % меньше прочности при растяжении для контрольных образцов, что может свидетельствовать о минимальном уровне биодеградации образцов и согласуется с данными эксперимента по грибостойкости.

Таблица 7

Результаты испытания при растяжении контрольных образцов пленок ПВХ,

не подвергавшихся испытанию на грибостойкость

Таблица 8

Результаты испытания при растяжении образцов пленок ПВХ, предварительно

подвергнутых испытанию на грибостойкость по ГОСТ 9.049–91 (метод 1)

Таблица 9

Результаты испытания при растяжении образцов пленок ПВХ, предварительно

подвергнутых испытанию на грибостойкость по ASTMG21-15

Заключения

Установлено, что из исследованных пленочных материалов наибольший рост микромицетов наблюдается у образцов ПВХ: грибостойкость при испытании по ГОСТ 9.049–91 (метод 1) составила 5 баллов, при испытании по ASTM G21-15: 4 балла. Результаты испытания на растяжение пленок ПВХ подтверждают минимальный уровень биодеградации образцов.

Наличие некоторой закономерности в результатах после проведения измерений не позволяет достоверно судить о тенденции в изменении массы образцов. Так, несмотря на отмеченное интенсивное развитие микромицетов, потеря массы у образцов из пленочного ПВХ составила только 0,4 % (испытание по ГОСТ 9.049–91 (метод 1)) и 0,2 % (испытание по ASTM G21-15).

Для более подробного исследования процесса биодеградации пленочных полимерных материалов необходимо проведение более длительных испытаний на стойкость к воздействию плесневых грибов.

Статья подготовлена в рамках выполнения работ по гранту РФФИ № 18-53-34006 «Реакции автотрофных и гетеротрофных биологических систем на деградацию материалов в естественных условиях с последующим изучением сукцес-сионных изменений экосистемы в тропическом климате».