Введение

Первичные продукты нефтепереработки применяются для синтеза исходных компонентов в производстве полимерных материалов. Полиэфирные и поливиниловые волокна, адгезивные покрытия, связующие и клеи в составе полимерных композиционных материалов могут иметь множество вариантов исполнения в зависимости от назначения конечного продукта. Такие полимерные материалы, как полиэтилентерефталат (ПЭТФ) и поливинилхлорид, полиакрилаты и эпоксидные смолы, широко распространены благодаря уникальным физико-химическим свойствам, механическим характеристикам и стойкости к воздействию окружающей среды.

Учитывая совокупный объем произведенных и импортированных производных олефиновой и ароматической фракций нефти, насчитывающих десятки наименований, можно предположить, что как минимум несколько сотен тысяч тонн полимерных материалов не будут подвергнуты рециклингу или полной переработке и останутся в окружающей среде. Это обстоятельство является серьезной экологической проблемой, поскольку ни один из упомянутых полимерных материалов не подвержен быстрому биологическому разложению [1, 2].

Скорость процесса биодеструкции полимеров в окружающей среде в первую очередь определяется химическим составом и степенью кристалличности материала, а также интенсивностью воздействия климатических факторов, важнейшими из которых являются температура и влажность [3–8]. Происходит изменение физико-механических (потеря формы, массы, снижение вязкости, гибкости, охрупчивание) и химических (разрыв химических связей, снижение молекулярной массы мономеров) свойств материала. На этапе дезинтеграции материал получает необратимые повреждения, которые при участии микроорганизмов сначала приводят к фрагментации материала и в дальнейшем к его минерализации, подразумевающей полную деполимеризацию с образованием диоксида углерода, метана и воды в зависимости от конечного акцептора электронов [9–12].

Одним из наиболее часто упоминаемых бактериальных штаммов биодеструкторов является Ideonella sakaiensis 201-F6, для которого установлен биохимический механизм утилизации ПЭТФ, включая структуру и активность ключевых ферментов деполимеризации и дальнейшей метаболической ассимиляции частей мономера – терефталевой кислоты и этиленгликоля [13, 14]. С химической точки зрения ПЭТФ является инертным полимером за счет наличия ароматических компонентов с эфирными связями в составе мономера. Однако ПЭТФ, использованный в эксперименте с культурой Ideonella sakaiensis 201-F6, имел достаточно низкую кристалличность (1,9 %), в то время как ПЭТФ, применяемый для изготовления тары и упаковок, имеет кристалличность от 30 до 40 %, что существенно снижает его биодоступность [1, 13, 14].

В данной работе демонстрируется практическая возможность получения из сложных эндемических сообществ микроорганизмов чистых культур бактериальных штаммов рода Pseudomonas как наиболее активных в отношении органических соединений, в том числе токсичных, и растворимых в воде полимеров, применяемых в производстве материалов.

Материалы и методы

Химический состав оборотной охлаждающей воды нефтеперерабатывающего (НПЗ) и нефтехимического (НХЗ) заводов определен в испытательном лабораторном центре ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в республике Башкортостан» в соответствии с сертифицированными методами исследования (см. приложение, табл. 1 и 2).

Для экспонирования с бактериальной культурой использовали образцы материалов размером 25×70×1,5 мм (табл. 1). Перед взаимодействием с микроорганизмами поверхность контрольных и опытных образцов, размещенных на пластиковой подложке, обрабатывали раствором 0,3%-ной соляной кислоты и выдерживали в течение 12 ч при комнатной температуре. Затем дважды образцы выдерживали в течение 6 ч в камере светопогоды в диапазоне длин волн ультрафиолетового излучения 300–400 нм при плотности потока 65 Вт/м² и относительной влажности ~25 %.

Таблица 1

Материалы, использованные для экспонирования с бактериальной культурой

Образцы материалов фотографировали с помощью зеркальной фотокамеры Canon EOS 5D Mark III с объективом EF 100mm f/2.8L Macro.

Для получения первичных бактериальных культур из каждого образца воды НПЗ и НХЗ в соответствии с общим микробным числом (ОМЧ) отбирали определенный объем и переносили в 50 мл базовой минеральной среды с добавлением 1 % (объемн.) стерильного дизельного топлива марки ДТ-Л-40-К2 (ГОСТ 305–2013). Состав среды, мМ: 7 – KH₂PO₄; 5 – K₂HPO₄; 20 – NH₄Cl; 10 – NaCl; 0,8 – MgSO₄·7H₂O; 0,18 – CaCl₂; pH = 7.

Базовую среду стерилизовали автоклавированием при температуре 121 °C в течение 15 мин.

Для замедления или предотвращения возможного роста микромицетов добавляли 50 мкл раствора амфотерицина В в 50%-ном этиловом спирте с исходной концентрацией действующего вещества 100 мг/мл.

Культуры наращивали в течение не менее 72 ч при температуре 25 °C и скорости перемешивания 140 мин^–1.

Полученные первичные бактериальные культуры высевали на твердую базовую минеральную среду, содержащую 1 % агарозы и 0,01 % дрожжевого экстракта, для проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР) отдельных колоний и идентификации секвенированием.

Для экспонирования материалов подготовленные опытные образцы помещали в 20 мл базовой минеральной среды, содержащей смесь первичных бактериальных культур плотностью ~0,05 ОЕ/мл, полученную смешиванием в равных пропорциях первичных культур для каждого образца воды НПЗ и НХЗ. Контрольные образцы материалов помещали в 20 мл базовой минеральной среды без добавления бактериальных культур. Контрольные и опытные образцы материалов экспонировали в течение 60 дней при температуре 25 °C и скорости перемешивания 50 мин^–1. В табл. 2 приведены сведения о соответствии наименований образцов материалов и полученных проб для секвенирования.

Таблица 2

Соответствие наименований образцов материалов и полученных проб

для секвенирования на каждом этапе отбора

Для получения чистых культур штаммов бактерий проводили рассев аликвот культуральной жидкости, полученной после экспонирования первичных культур с материалами, на твердые базовые минеральные среды, содержащие 1 % агарозы и 0,025 % стерильных субстратов акриловой дисперсии или поливинилового спирта. Полученные отдельные колонии снова засевали в жидкие базовые минеральные среды с теми же субстратами. Полученные отдельные колонии идентифицировали секвенированием.

При подсчете колоний выявлено низкое ОМЧ при экспонировании с клеевой пленкой ВК-102А (B2), поэтому в целях экономии расходных материалов и времени данная проба исключена из дальнейшего отбора.

Для получения данных о показателях роста выделенных чистых культур бактерий на топливах использовали 3 мл базовой минеральной среды с добавлением 3 мл дизельного топлива марки ДТ-Л-40-К2 (ГОСТ 305–2013) или реактивного топлива марки ТС-1 (ГОСТ 10227–86). Данные о кинетике роста получали в течение 96 ч при температуре 25 °C и начальной плотности исследуемых культур 0,025 ОЕ/мл без перемешивания, пробирки в течение всего времени испытаний находились в вертикальном положении. В качестве отрицательного контроля использовали чистую среду с указанными видами топлив.

Оптическую плотность бактериальных культур в контрольных и опытных образцах определяли с помощью спектрофотомера ПЭ-5000 (Экрос, Россия) при длине волны 600 нм. Кинетику роста определяли по формуле

K = tg(A₂₄ – A₀),

где А₀ и А₂₄ – поглощение среды исходное и через 24 ч при длине волны 600 нм.

Для амплификации V4-фрагментов 16S рРНК бактерий использовали модифицированные олигонуклеотидные праймеры 515f и 806r [15]. Концентрацию препаратов ДНК определяли флюориметрическим методом с помощью набора QuDye BR (Люмекс, Россия) согласно инструкции. Геномную ДНК, полученную с помощью набора для выделения ДНК на селикагелевых колонках, в количестве ~50 нг добавляли в 100 мкл смеси для ПЦР, содержащей HS Taq ДНК-полимеразу, реакционный буфер, дезоксинуклеозидтрифосфаты и соответствующие синтетические олигонуклеотиды (Евроген, Россия). Реакции выполняли в автоматическом цифровом программируемом термоциклере (амплификаторе) с нагреваемой крышкой при следующих параметрах: 95 °C в течение 5 мин; 95 °C в течение 30 с, 60 °C в течение 30 с, 72 °C в течение 10 с (30 циклов); 72 °C в течение 5 мин. Полученные ПЦР-фрагменты очищали с помощью реагента фракционирования ДНК на магнитных частицах в соответствии с инструкцией производителя.

Результаты ПЦР визуализировали с помощью электрофореза в 1,5%-ном агарозном геле для молекулярной биологии в однократном трис-ацетат-ЭДТА буфере с красителем бромид этидия в количестве 0,5 мкг/мл (Хеликон, Россия). Для электрофореза использовали четырехканальный источник питания с выходным напряжением 5000 В с постоянным током 8 В/см агарозного геля. Для определения размера ДНК-фрагментов, получаемых в результате ПЦР, использовали маркеры молекулярной массы с размерами 100, 200, 300, 500, 700, 1000, 1500, 2000, 3000, 5000, 7000 и 10000 пар нуклеотидов.

Для амплификации ДНК полноразмерного фрагмента 16S рРНК бактерий использовали модифицированные олигонуклеотиды 27f и 1492r [16]. Параметры реакции: 95 °C в течение 5 мин; 95 °C в течение 30 с, 58 °C в течение 30 с, 72 °C в течение 1 мин (30 циклов); 72 °C в течение 5 мин. Для выделения ДНК из агарозного геля использовали набор LumiPure (Lumiprobe, Россия). Результаты ПЦР визуализировали с помощью электрофореза с указанными ранее параметрами и оборудованием. Данные о первичной структуре выделенных ДНК-фрагментов получены в компании Евроген (Москва) на генетическом анализаторе 3500хL. Сборка и валидация перекрывающихся прочтений выполнены в специализированной программе [17].

Данные коротких прочтений V4-фрагмента гена 16S рРНК бактерий получены с помощью высокопроизводительного секвенатора с набором реагентов для секвенирования nano kit, v2 (500 cycles), работы выполнены согласно официальному руководству компании изготовителя. Качество прочтений анализировали с помощью соответствующей программы (см. приложение, рис. 1) [18]. Удаление адаптеров, сборка перекрывающихся прочтений, выравнивание по базе данных первичных структур гена 16S рРНК архей и бактерий, визуализации выполнены с применением модулей программы reporter v.2.6.2.3.

Для ПЦР-исследования отдельных колоний первичных культур использовали специфичные для рода Pseudomonas праймеры PSF2 и PAGS-R [19]. Реакции выполняли при следующих параметрах: 95 °C в течение 3 мин; 95 °C в течение 30 с, 60 °C в течение 30 с, 72 °C в течение 30 с (30 циклов); 72 °C в течение 5 мин. Для выявления наличия плазмид incP9 использовали олигонуклеотиды rep9F и rep9R [20]. Для поиска генов диоксигеназ ароматических соединений применяли праймеры TOD-F и TOD-R [21]. Реакции выполняли при следующих параметрах: 95 °C в течение 3 мин; 95 °C в течение 30 с, 55 °C в течение 30 с, 72 °C в течение 30 с (35 циклов); 72 °C в течение 5 мин. Реагенты и оборудование для ПЦР указаны ранее. Результаты ПЦР визуализировали с помощью электрофореза с указанными ранее параметрами и оборудованием.

Работа выполнена при поддержке ЦКП «Климатические испытания» НИЦ «Курчатовский институт» – ВИАМ.

Результаты и обсуждение

Таксономическая идентификация первичных бактериальных культур, полученных на первом этапе отбора, демонстрирует, что образец на 95 % состоит из бактерий рода Pseudomonas (рис. 1). Такой результат связан в первую очередь с составом базовой минеральной среды и, по-видимому, с высоким содержанием бактерий указанного рода в исходных образцах оборотной охлаждающей воды НПЗ и НХЗ.

Рис. 1. Наиболее представленные виды бактерий рода Pseudomonas в пробе D-MC с указанием абсолютного количества прочтений V4-фрагмента 16S рРНК каждого из идентифицированных видов бактерий в процессе секвенирования (% of total reads). Чем больше абсолютное количество прочтений V4-фрагмента 16S рРНК, тем выше физическое количество клеток бактерий соответствующего таксона в пробе

На этом этапе решено провести ПЦР-исследование отдельных колоний первичных культур для выяснения эффективности такого подхода к поиску целевых фенотипов бактериальных штаммов. Для этого выбраны две последовательности мишени, одна из которых представляет собой участок плазмидного репликонаincP9, а вторая – участок гена todC1,кодирующего диоксигеназу бензола, толуола и хлорбензола. При этом ген todC1, по-видимому, имеет хромосомную локализацию в бактериальной клетке.

С учетом того, что указанные плазмиды и ген todC1 найдены исключительно в бактериях рода Pseudomonas, необходимо установить, что каждая из отобранных колоний относится к этому роду (см. приложение, рис. 2).

Как можно убедиться, каждая из 18 отобранных колоний является представителем рода Pseudomonas. Эти данные хорошо согласуются с анализом 16S рРНК первичных культур в пробе D-MC, которые служили источником для ПЦР-исследования.

Дальнейший ПЦР-анализ 18 образцов с олигонуклеотидами rep9F/rep9R и TOD-F/TOD-R выявил предположительное наличие этих последовательностей ДНК только в одном образце (см. приложение, рис. 3).

Хотя для полной уверенности в том, что амплифицированные фрагменты ДНК действительно являются участками repA и todC1, необходимо секвенирование полученных в результате ПЦР фрагментов ДНК. Данный образец культуры выбран для дальнейшего анализа в качестве результата применения такого подхода к поиску редких фенотипов бактерий.

Полученный штамм в одном из запусков секвенирования в качестве отдельного образца идентифицирован по V4-фрагменту 16S рРНК как Pseudomonas plecoglossicida (см. приложение, рис. 4).

Перед экспонированием с первичной культурой образцы материалов целенаправленно повреждали с помощью соляной кислоты и УФ-излучения (см. приложение, рис. 5). Одним из результатов такого рода воздействий является также полная стерильность каждого образца материала вследствие длительного воздействия перечисленных факторов.

Для экспонирования с первичной культурой бактерий не использовали контрольные образцы материалов, не прошедшие подготовку описанным способом. Это связано с тем, что с учетом указанной цели исследования испытаниям подвергали культуру микроорганизмов, а материалы служили в качестве инструмента, поэтому отрицательными контролями выступили прошедшие соответствующую подготовку материалы без добавления к стерильной среде микроорганизмов.

После 60 дней экспонирования из каждого образца материалов с первичной культурой бактерий отобрана часть среды для получения смешанной культуры в пробе AG-Mix. Анализ пробы AG-Mix демонстрирует существенное увеличение видов бактерий по сравнению с первичной культурой в пробе D-MC, что является следствием появления в ранге класса и ниже дополнительных таксонов (рис. 2 и 3).

Причиной перераспределения таксономического состава популяции бактерий из первичных культур после экспонирования с образцами материалов является изменение химического состава исходной минеральной среды в результате перехода органических и минеральных компонентов материалов в растворимое или коллоидное состояние в течение длительного времени. Кроме того, не исключены различного рода взаимодействия бактерий с поверхностными и подповерхностными участками материалов, включая биопленки или другие структуры. Эти обстоятельства приводят к наращиванию ранее некультивируемых и/или плохо растущих в исходной среде бактерий. В то же время происходит подавление роста или элиминация тех штаммов, которые не способны выжить в данных условиях внешней среды при тотальном сокращении общего микробного числа в пробах.

Рис. 2. Наиболее представленные таксоны бактерий в пробе AG-Mix

Рис. 3. Видовой состав пробы AG-Mix с указанием абсолютного количества прочтений V4-фрагмента 16S рРНК в процессе секвенирования (% of total reads)

На заключительных этапах отбора отдельные культуры, полученные в результате экспонирования с соответствующими материалами, переносили в базовую минеральную среду с добавлением в качестве единственного источника углерода поливинилового спирта или стирол-акриловой дисперсии. Применение указанных субстратов способствовало дальнейшей дифференциации культур и их обогащению наиболее активными фенотипами (рис. 4; см. приложение, рис. 6). С учетом того факта, что химически и структурно эти субстраты абсолютно разные, они позволяют выявить материал, вносящий наибольший вклад в таксономическое разнообразие культуры, в пробе AG-Mix.

В результате переноса культур после экспонирования с материалами в среду с поливиниловым спиртом происходит обогащение сообщества бактерий изначально мало представленными и плохо культивируемыми штаммами Pseudomonas, в то время как в присутствии стирол-акрилатов увеличивается представленность штаммов Ochrobactrum, Delftia, Pseudoxanthomonas, Achromobacter и снижается изначально высокая концентрация штаммов Pseudomonas. Появление в питательной среде стирол-акрилатов в составе с анионными эмульгаторами модифицирует среду,смещая фокус отбора на другие таксоны бактерий. Это, в частности, объясняет обогащение пробы AG-Mix видами бактерий, представленность которых увеличилась после экспонирования первичных культур из пробы D-MC с материалом Акрэмос-140.

Рис. 4. Видовые составы проб E1 PVA (а) и E1 SA (б) с указанием абсолютного количества прочтений V4-фрагмента 16S рРНК в процессе секвенирования (% of total reads)

Штамм Methylobacterium goesingense,высоко представленный в пробе AG-Mix (рис. 2 и 3), при наращивании на соответствующих субстратах практически полностью элиминируется (рис. 4; см. приложение, рис. 6). Это, по-видимому, связано с отсутствием метаболических компетенций в отношении использованных субстратов и возросшей конкуренцией со стороны других штаммов, подавляющих его рост.

На рис. 5 представлена сводная диаграмма наиболее представленных бактериальных штаммов в культурах, полученных в результате отбора.

Для получения чистых культур наиболее активных штаммов Ps. viridiflava и/или Ps. japonica выбрана бактериальная культура из пробы C3 PVA, полученная в результате наращивания в поливиниловом спирте бактерий, выделенных после экспозиции первичных культур с отвержденной стирол-акриловой дисперсией Акрэмос-140.

Штамм Ps. japonicaотдельно идентифицирован путем секвенирования полноразмерной последовательности гена 16S рРНК, полученной из чистой культуры. Данные о нуклеотидной последовательности доступны в GeneBank NCBI (Accession number: PQ432336).

Рис. 5. Представленность идентифицированных видов бактерий в пробах. Идентифицированные в каждой пробе виды бактерий с абсолютным количеством прочтений V4-фрагмента 16S рРНК в процессе секвенирования (% of total reads) <1 % не учитывали

Для получения данных о показателях роста на двух видах топлив использовали чистые культуры штаммов Ps. plecoglossicida и Ps. japonica (см. приложение, рис. 7), выделенные до и после экспонирования с материалами соответственно (рис. 6).

Рис. 6. Кривые роста чистых культур штаммов Ps. japonicaи Ps. plecoglossicidaна дизельном (Дт) и реактивном топливе (Рт)

Показано более чем двукратное превышение скорости роста штамма Ps. japonica на реактивном топливе и двукратное – на дизельном топливе по сравнению со штаммом Ps. plecoglossicida (рис. 7).

Полученные данные хорошо согласуются с результатами секвенирования пробы D-MC (рис. 1), в которой штамм Ps. plecoglossicida изначально является одним из доминирующих. На следующих этапах отбора во всех пробах (рис. 1–4; см. приложение, рис. 6) можно наблюдать снижение концентрации этого штамма одновременно с увеличением концентрации других штаммов Pseudomonas, главным образом Ps. viridiflava и Ps. japonica. Это наблюдение свидетельствует о том, что полученные виды бактерий не являются результатом накопления мутаций (мутагенеза) в процессе длительного экспонирования с материалами, поскольку перечисленные штаммы изначально находились в смеси в равных условиях и имели некоторые шансы накопить при экспозиции полезные мутации. При этом у штамма Ps. plecoglossicida, по-видимому, таких шансов было кратно больше, с учетом его концентрации в пробе D-MC (13,76 %), по сравнению с Ps. japonica и Ps. viridiflava (1,56 и 1,21 % соответственно).

Рис. 7. Кинетика роста чистых культур штаммов Ps. japonica и Ps. plecoglossicida на дизельном и реактивном топливе, полученных в интервале от начала роста до 24 ч

Полученные данные и результаты их анализа позволяют также констатировать, что ПЦР-исследование как способ поиска желаемых бактериальных фенотипов в таксономически неоднородных сообществах микроорганизмов весьма трудоемко, обладает низкой эффективностью и более пригодно для детального анализа отдельных видов бактерий.

Заключения

Представленный метод может быть полезен для получения из сложных эндемических сообществ микроорганизмов редких фенотипов бактерий, в том числе биодеструкторов, некультивируемых или плохо культивируемых в богатых питательных средах. Гибкость в выборе субстратов и материалов обеспечивает достаточный уровень масштабируемости – предложенный метод может применяться не только в отношении штаммов Pseudomonas, но и для поиска желаемых фенотипов бактерий в других таксонах. Некоторые из полученных таким способом микроорганизмов могут оказаться естественными продуцентами ценных биологически активных веществ, в том числе биоцидных препаратов, найти применение в методиках испытаний топлив на стойкость к воздействию микроорганизмов, применяться для утилизации материалов или устранения последствий загрязнения нефтепродуктами окружающей среды.

Приложение к статье «Выделение бактериальных штаммов деструкторов

полимерных материалов из образцов оборотной охлаждающей воды

нефтеперерабатывающего и нефтехимического заводов» (автор: В.Ю. Ермишев)

Таблица 1

Химический состав оборотной охлаждающей воды нефтехимического завода

Таблица 2

Химический состав оборотной охлаждающей воды нефтеперерабатывающего завода

Рис. 1. Результаты анализа качества прочтений проб D-MC (а), AG-Mix (б), A2 PVA (в),
C3 PVA (г), E1 PVA (д), F2 PVA (е), E1 SA (ж) и F2 SA (з). Показатель «Qquality score» (Q) показывает качество прочтений каждого нуклеотида во всех отсеквенированных фрагментах ДНК участка гена 16S рРНК бактерий. Качество прочтений рассчитывали по формуле Q = 10log₁₀P, где P – вероятность ошибки секвенирования. Например, если Р = 0,001, то Q = 30. Это означает, что только 1 нуклеотид из 1000 может быть встроен в цепь ДНК ошибочно. Поэтому Q =30  является пороговым значением для результатов секвенирования с высоким уровнем доверия. Желтые маркеры показывают интервал значений Q по всем прочтениям выборки, красные метки – среднее значение Q, рассчитанное на основе интервала значений Q. Черные «хвосты» указывают на теоретически возможный разброс значений с учетом полученных интервальных значений Q. Перечисленные параметры являются результатом более сложных расчетов, основанных на Q-весовой матрице, откалиброванной производителем, согласно модели секвенатора и передаваемой программе FastQC в соответствующей кодировке, в данном случае – Sanger/Illumina 1.9

Рис. 2. Результат амплификации участка гена 16S рРНК размером 375 пар нуклеотидов с олигонуклеотидными праймерами PSF2 и PAGS-R, специфичными для бактерий рода Pseudomonas. М – маркер длин фрагментов ДНК (#SM1103), К – отрицательный контроль реагентов ПЦР, 1–18 – номера колоний

Рис. 3. Результат амплификации ДНК-фрагментов для геновtodC1 (757 пар нуклеотидов) и repA (480 пар нуклеотидов). М – маркер длин фрагментов ДНК (#SM1283), К – отрицательный контроль реагентов ПЦР 

Рис. 4. Результат идентификации по V4-фрагменту 16S рРНК штамма Pseudomonas plecoglossicida. Для идентификации использовали культуру, полученную из отдельной колонии. Незначительная примесь посторонних прочтений (2,9 %) связана с экстремально высокой чувствительностью высокопроизводительного секвенатора, который предназначен для анализа сложных сообществ микроорганизмов. Если в смеси присутствует слишком большое количество одинаковых прочтений, могут возникнуть артефакты, связанные с указанной спецификой оборудования

Рис. 5. Образцы материалов A2, B2, E1, F2 и C3, использованных для экспонирования с бактериальными культурами: 1 – исходные; 2 – после воздействия соляной кислоты и первой выдержки в камере светопогоды; 3 – после второй выдержки в камере светопогоды; 4, 5 – после экспонирования с культурами микроорганизмов

Рис. 6. Видовые составы проб A2 PVA (а), C3 PVA (б), F2 PVA (в) и F2 SA (г) с указанием абсолютного количества прочтений V4-фрагмента 16S рРНК в процессе секвенирования (% of total reads)

Рис. 7. Чистые культуры бактериальных штаммов Pseudomonas plecoglossicida (а) и Pseudomonas japonica PQ432336 (б)