Введение

На протяжении нескольких десятилетий в НИЦ «Курчатовский институт» – ВИАМ проводятся комплексные исследования микробиологической стойкости материалов. Этот процесс включает непрерывное выделение и изучение микроорганизмов, колонизирующих поверхности различной техники и конструкций. За годы работы в институте накоплена значительная коллекция микроорганизмов-деструкторов и контаминантов материалов [1–3]. Основу коллекции составляют культуры микроскопических грибов, полученные из образцов материалов и конструктивных элементов, подвергнутых испытаниям на специализированных микробиологических площадках в различных климатических зонах. Кроме того, в лаборатории регулярно проводятся микробиологические анализы эксплуатируемой техники с выявлением признаков микробиологических повреждений. В таких случаях культуры микроорганизмов-деструкторов выделяются непосредственно из пораженных участков. Полученные штаммы представляют особую ценность для дальнейшего изучения их физиологических особенностей и применения в лабораторных тестах на микробиологическую стойкость материалов и изделий.

Коллекция мицелиальных грибов обладает высоким научным и практическим потенциалом. Ее можно использовать для оценки микробиологической стойкости материалов и изделий, а также для определения эффективности биоцидных препаратов, антисептиков и других средств, направленных на борьбу с биоповреждениями. Кроме того, культуры грибов-деструкторов перспективны для разработки технологий переработки отходов и препаратов для биоремедиации, что подчеркивает их значимость для экологических исследований [4–8].

Цель данной работы – таксономическая идентификация культур мицелиальных грибов депозитария НИЦ «Курчатовский институт» – ВИАМ с помощью методов секвенирования.

Материалы и методы

Подготовлены чашки Петри с питательной средой сусло-агар. Проведена реизоляция 200 культур мицелиальных грибов из замороженных и лиофилизированных препаратов, хранящихся в депозитарии НИЦ «Курчатовский институт» – ВИАМ, путем высева инокулюма на поверхность питательной среды. Чашки Петри с инокулюмом заклеивали парафильмом и инкубировали в термостатах при температуре 28 °С в течение 10–14 дней. После проведения инкубации проверяли идентичность и чистоту культур, при необходимости повторяли процедуру пересевов на новые чашки Петри с питательной средой.

Молекулярную диагностику проводили в Курчатовском геномном центре с помощью двух подходов: анализ геномных сигнатур и полноценный филогенетический анализ по 255 маркерным однокопийным генам эукариот.

С культур на чашках Петри выделяли геномную ДНК, далее измеряли концентрацию и оценивали качество полученной ДНК, проводили дополнительную очистку. Подготовка библиотек для геномного секвенирования проведена для 100 нг очищенной ДНК культур на чашках Петри. Каждый образец фрагментирован в режиме, оптимальном для получения фрагментов длиной ~(300–400) нуклеотидов. После фрагментации ДНК очищали от низкомолекулярных фрагментов с помощью магнитных частиц. Качество фрагментации оценено с помощью системы капиллярного электрофореза и набора реагентов (рис. 1).

Рис. 1. Электрофореграмма фрагментированной ДНК (35 и 10380 – нижний и верхний маркеры длин)

Дальнейшая подготовка библиотек проведена с помощью набора реагентов для подготовки NGS-библиотек (Next Generation Sequencing – секвенирование нового поколения) и набора адаптеров для секвенирования ДНК.

Процесс получения библиотек включал следующие этапы:

– ферментативное восстановление поврежденных концов ДНК;

– лигирование к фрагментированной ДНК адаптеров для индивидуальной маркировки библиотек;

– наработка библиотек c помощью полимеразной цепной реакции.

Полученные библиотеки очищены от низкомолекулярных фрагментов с помощью магнитных частиц. Подготовка библиотек для геномного секвенирования проведена для 50 нг очищенной ДНК культур на чашках Петри с помощью набора для приготовления библиотек.

Процесс получения библиотек включал следующие этапы:

– ферментативная фрагментация ДНК и лигирование к фрагментированной ДНК адаптеров;

– ввод индексной последовательности для индивидуальной маркировки библиотеки и наработка библиотек c помощью полимеразной цепной реакции.

Полученные библиотеки очищены от низкомолекулярных фрагментов с помощью магнитных частиц. Концентрацию готовых библиотек оценивали на флуориметре с использованием наборов реагентов. Качество готовых библиотек оценивали по электрофореграмме, полученной с помощью системы автоматического электрофореза нуклеиновых кислот и набора реагентов (рис. 2).

После оценки качества библиотеки пулировали эквимолярно. Далее проводили циркуляризацию библиотек, подготовку ДНК-наношариков (DNA-nanoballs) и секвенирование согласно инструкции производителя с использованием парно-концевых прочтений по 150 нуклеотидов [9–11].

Два образца, для которых получено недостаточное количество прочтений, секвенировали с использованием системы парно-концевых прочтений по 150 нуклеотидов.

Рис. 2. Библиотека, полученная с помощью набора, для образцов культур на чашках Петри (Lower и Upper – нижний и верхний маркеры длин)

Предварительная обработка прочтений включала три этапа:

– обрезка прочтений по качеству и их фильтрация;

– корректировка прочтений;

– нормализация данных секвенирования.

На этапе обрезки и фильтрации прочтения обработаны: удалены участки прочтений со средним качеством <21, удалены служебные последовательности (адаптеры), участки полигуанина на концах прочтений длиной >4 нуклеотидов, отброшены прочтения длиной <33 нуклеотидов [12]. В среднем при строгих параметрах фильтрации отфильтровано <20 % нуклеотидов и <10 % прочтений. Усредненные результаты обрезки и фильтрации представлены на рис. 3.

Рис. 3. Распределение плотности вероятности доли отфильтрованных оснований (а) и прочтений (б) по всем образцам

Корректировка прочтений с применением таблиц k-меров выполнена с использованием стандартных настроек по умолчанию и выделением необходимого объема оперативной памяти. Ошибки секвенирования найдены в ~20 % прочтений, >80 % обнаруженных ошибок устранено. Корректировка и нормализация данных секвенирования позволяют получать более качественные геномные сборки за счет уменьшения количества прочтений с ошибками и возможных контаминантов, а также снижения избыточности данных.

Нормализация данных секвенирования выполнена со следующими параметрами: минимальное необходимое и целевое покрытие k-мерами составило 5 и 100 соответственно.

Выбор утилит обусловлен высокой скоростью работы, эффективной параллелизацией и широким набором функций.

De novo сборка геномов выполнена в программе [13], используемой в основном для сборки метагеномов, однако показывающей результаты по качеству сборки на уровне, полученном в работе [14], при этом затрачивается значительно меньше вычислительных ресурсов, что позволяет работать с большими массивами данных. Результаты на тестовом наборе данных также превзошли результаты, полученные с помощью программы [15], используемой для сборки геномов эукариот. Для полученных геномных сборок собрана статистика по количественным характеристикам: суммарная длина генома, N50, количество контигов и др. Полнота и контаминация геномов оценены [16] для набора однокопийных маркерных генов, характерных для царства Fungi. Для девяти геномов (штаммы viam 222, viam 133, viam 037, viam 146, viam 026, viam 205, viam 169, viam 097 и viam 175) доля представленных в одной копии маркерных генов составила <90 %. Для большинства образцов это объясняется фрагментированностью сборки, которой не удается избежать даже при тщательной предварительной обработке данных секвенирования. Геном штамма viam 121 продемонстрировал долю однокопийных генов в двух и более копиях 5,3 %, что, однако, не помешало дальнейшей работе.

Для всех геномных сборок предсказаны белок-кодирующие гены для последующего функционального анализа и таксономической классификации.

Работа выполнена при поддержке ЦКП «Климатические испытания» НИЦ «Курчатовский институт» – ВИАМ.

Результаты и обсуждение

В предыдущих частях данной статьи представлены результаты молекулярной идентификации штаммов следующих таксонов: порядокGlomerellales,родColletotrichum;семействоPleosporaceae;роды Curvularia иAlternaria,род Aspergillus и представители новых порядков класса Sordariomycetes;род Penicillium;порядок Xylariales,роды Nigrospora, Neopestalotiopsis, Pestalotiopsis,Daldinia; род Cladosporium;род Sarocladium;порядок Hypocreales;порядок Mucorales, род Rhizopus;род Trichoderma;род Fusarium и др.

Далее анализ данных геномных сигнатур [16–19] показал, что штаммы viam 048-1 и viam 040относятся к семейству Chaetomiaceae класса Sordariomycetes. Согласно геномным сигнатурам, оба штамма отнесены к роду Chaetomium. Однако анализ филогенетического древа показал, что оба штамма имеют значительную глубину ветвления с геномами описанных типовых штаммов (рис. 4, а). Это может свидетельствовать о том, что они представляют собой новые рода.

По анализу данных геномных сигнатур определено, что штаммы viam 137 cl3, viam 132, viam 233, viam 184, viam 245, viam 238, viam 062, viam 228, viam 214, viam 149 и viam 127относятся к порядку Pleosporales, но различаются на уровне семейств. Штамм viam 137 cl3 относится к виду Nothophoma quercina, штамм viam 132 – к роду Didymella, штаммы viam 062, viam 228, viam 214, viam 149 и viam 127 – к роду Epicoccum, а штаммы viam 233, viam 184, viam 245 и viam 238 определены только до порядка Pleosporales.

Анализ филогенетического древа подтверждает принадлежность данных штаммов к порядку Pleosporales (рис. 4, б). При этом штамм viam 137 cl3 формирует глубокую ветвь и, вероятно, является представителем вида Nothophoma quercina,геном которого отсутствовал в базе данных типовых штаммов NCBI.Штамм viam 132, по-видимому, относится к виду Didymellaglomerata. Штаммы viam 062, viam 228, viam 214, viam 149 и viam 127 могут относиться к роду Epicoccum, геном которого также отсутствует в базе данных типовых штаммов. Штаммы viam 233, viam 184, viam 245 и viam 238, вероятно, образуют новый род порядка Pleosporales.

Рис. 4. Фрагменты общего филогенетического древа царства Fungi, класса Sordariomycetes (а) и порядка Pleosporales (б), полученного с помощью филогенетического анализа 255 однокопийных эукариотических генов

По анализу данных геномных сигнатур определено, что штаммы viam 111, viam 042, viam 193 и viam 162подразделяются на два порядка – Hypocreales и Erysiphales. Штаммы viam 193 и viam 162 определены до семейства Cordycipitaceae, штамм viam 111 – до вида Purpureocillium lilacinum (порядок Hypocreales), штамм viam 042 – до вида Golovinomyces magnicellulatus, порядок Erysiphales.

Однако, согласно данным филогенетического древа, все штаммы кластеризуются в пределах порядка Hypocreales (рис. 5). Штамм viam 111 относится к виду Purpureocillium lilacinum, а штаммы viam 193 и viam 162 кластеризуются с видом Beauveria rudraprayagi семейства Cordycipitaceae,по-видимому представляя новые виды данного рода. В свою очередь штамм viam 042 формирует более глубокую ветвь в этом кластере и, возможно, представляет собой новое семейство.

Анализ данных геномных сигнатур показал, что штаммы viam 080, viam 226, viam 221 и viam 178 относятся к классу Leotiomycetes. Штаммы viam 226 и viam 178 относятся к роду Botrytis, при этом штамм viam 178 определяется как Botrytis cinerea. Штаммы viam 080 и viam 221 определяются только до отдела Ascomycota.

Рис. 5. Фрагмент общего филогенетического древа царства Fungi, порядка Hypocreales, полученного с помощью филогенетического анализа 255 однокопийных эукариотических генов

Филогенетический анализ демонстрирует принадлежность штаммов viam 226, viam 221 и viam 178 к роду Botrytis (рис. 6). Штамм viam 080 кластеризуется с родом Xenosphaeropsis,однако глубина ветвления свидетельствует о том, что, возможно, он представляет собой новый род семейства Phacidiaceae.

Рис. 6. Фрагмент общего филогенетического древа царства Fungi, класса Leotiomycetes, полученного с помощью филогенетического анализа 255 однокопийных эукариотических генов

В результате анализа данных геномных сигнатур определено, что штаммы viam 147, viam 133, viam 218, viam 200, viam 220, viam 201, viam 097, viam 247, viam 159 и viam 188относятся к классу Dothideomycetes. При этом в порядок Dothideales выделены штаммы viam 147 (вид Delphinella strobiligena), viam 133, определенный до рода Aureobasidium, viam 218 (вид Aureobasidium pullulans) и штаммы, относящиеся к виду Aureobasidium melanogenum: viam 200, viam 201, viam 220, viam 097 и viam 247. Штамм viam 159 определился только до отдела Ascomycota, а штамм viam 188 – до рода Cercospora, порядок Mycosphaerellales.

По данным филогенетического анализа определено, что штаммы viam 133, viam 200, viam 201, viam 220, viam 097 и viam 247 относятся к роду Aureobasidium, при этом штаммы viam 200, viam 201 и viam 220 кластеризуются с видом Aureobasidium melanogenum, но, по-видимому, могут быть новыми видами (рис. 7). Штаммы viam 097 и viam 247 ближе всего к виду Aureobasidium melanogenum. Штаммы viam 133 и viam 218 кластеризуются с видами Aureobasidium namibiae и Aureobasidium subglaciale. Однако штамм viam 133 может быть представителем нового вида, а штамм viam 218 относится к виду Aureobasidium subglaciale. Штамм viam 147 формирует отдельную ветвь и относится к другому роду, вероятнее всего к Delphinella.

Рис. 7. Фрагмент общего филогенетического древа царства Fungi, класса Dothideomycetes, полученного с помощью филогенетического анализа 255 однокопийных эукариотических генов

Анализ данных геномных сигнатур показал, что штаммы viam 174, viam 028, viam 143, viam 101 и viam 102 относятся к одному порядку Eurotiales, но к разным семействам. Штаммы viam 174 (вид Talaromyces rugulosu), viam 143 (вид Talaromyces purpureogenus), viam 101 и viam 102 (род Talaromyces) относятся к семейству Trichocomaceae, в то время как штамм viam 028 – к семейству Aspergillaceae(что, по-видимому, ошибочно).

Согласно данным филогенетического анализа, все эти штаммы относятся к семейству Trichocomaceae. Штаммы viam 101, viam 102 и viam-143, вероятно, относятся к роду Talaromyces,штамм viam 174 представляет собой новый род, тогда как штамм viam 028 находится на грани между родом Talaromycesи новым родом (рис. 8).

Рис. 8. Фрагмент общего филогенетического древа царства Fungi, порядка Eurotiales, полученного с помощью филогенетического анализа 255 однокопийных эукариотических генов

Заключения

Проведена таксономическая идентификация штаммов мицелиальных грибов коллекции НИЦ «Курчатовский институт» – ВИАМ с помощью молекулярно-генетических методов в Курчатовском геномном центре. Получены данные по секвенированию представителей следующих таксонов: порядокGlomerellales,родColletotrichum;семействоPleosporaceae;роды CurvulariaиAlternaria,родAspergillusи представители новых порядков классаSordariomycetes;родPenicillium;порядокXylariales,родыNigrospora, Neopestalotiopsis,Pestalotiopsis,Daldinia; родCladosporium;род Sarocladium;порядок Hypocreales;порядок Mucorales, род Rhizopus;родTrichoderma;род Fusarium;семействоChaetomiaceae;порядокPleosporales, родыNothophoma,Didymella,Epicoccum;порядок Hypocreales иErysiphales,родыPurpureocillium,Beauveria;классLeotiomycetes,родBotrytis,семейство Phacidiaceae; классDothideomycetes,роды Delphinella,Aureobasidium;семействоTrichocomaceae,родTalaromycesи др.

В результате проведенной работы выявлено, что 235 штаммов коллекции мицелиальных грибов относятся к 124 видам и 42 родам микромицетов. Обнаружено, что более 40 новых штаммовмикромицетов отсутствуют в доступных базах данных и требуют дополнительного исследования деструктивной способности. Методами анализа ДНК подтверждено видовое соответствие тест-культур, применяемых в испытаниях на микробиологическую стойкость. Выявлены морфологически идентичные штаммы, которые являются разными видами по данным генетической идентификации. Обнаружены штаммы, относящиеся к одним видам, но выделенные в разных климатических зонах, соответственно, обладающие различными физиологическими свойствами.

Данные о видовом составе и филогенетических связях микроскопических грибов из коллекции представляют большую ценность для дальнейших исследований, в том числе для изучения их физиологических свойств и влияния на материалы в качестве агентов микробиологической деструкции.